酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事?最近做酶切,出现很奇怪的现象.我四种要酶切的样品,分别进行单酶切和双酶切,结果电泳结果是只有一个可以切出1KB片段的样品有条带,其他几个只需要
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/05/05 22:56:56
酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事?最近做酶切,出现很奇怪的现象.我四种要酶切的样品,分别进行单酶切和双酶切,结果电泳结果是只有一个可以切出1KB片段的样品有条带,其他几个只需要
酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事?
最近做酶切,出现很奇怪的现象.我四种要酶切的样品,分别进行单酶切和双酶切,结果电泳结果是只有一个可以切出1KB片段的样品有条带,其他几个只需要切出一个末端的样品却什么都没有.
酶切体系绝对一样,我是先总量混合在分装的.
不是没切开,电泳结果显示的是什么都没有就像直接点loading buffer进去一样.
我的酶切体系是这样的.
双酶切：12ul ddH2O、6ul tango buffer、1ul BamH1、1ul Hind3、10ul 样品质粒
单酶切：16ul ddH2O、3ul BamH1 buffer、1ul BamH1、10ul 样品质粒
顺便问下,我那个1KB的条带拖尾严重,是不是可能因为我酶切时间过长?我一般都是过夜12小时左右
关于质粒纯度问题，我四种样品都是用一种试剂盒提的。而且如果是纯度问题应该是随机出现在四种中，但是我两次都只有那个1KB的片段有条带。
质粒的上样量也没问题，我原始质粒对照上样量2ul条带很亮，酶切体系里质粒10ul稀释到30ul，上样量5ul，实际含量应该和原始质粒上样量差不多。
酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事?最近做酶切,出现很奇怪的现象.我四种要酶切的样品,分别进行单酶切和双酶切,结果电泳结果是只有一个可以切出1KB片段的样品有条带,其他几个只需要
建议你做如下改进：
1.原始质粒上样2ul,电泳检测,确定质粒质量没问题；
2.所有酶切体系均改为10ul,其中质粒2ul,酶0.1ul （双酶切时另一种酶也加0.1ul ）,buffer终浓度为 1×,剩下为去离子水.酶切时间为4小时左右.
3.电泳用的凝胶最好为新鲜配制的,浓度视质粒大小而定,一般为1%；
电泳的缓冲液最好也是新鲜配制的,电泳电压适当.
1KB的条带拖尾严重,可能是凝胶不新鲜,或者是电泳时电压过高,或者是酶切时间过长.上述建议中已经给出解决方法.
至于你说的奇怪现象,可能质粒已经降解,也可能是酶切过久导致降解,也可能是枪头或者离心管等器材污染,总之保证一切是新鲜的,再做一次.
1、我不建议酶用1ul，商品化的酶都是浓缩酶，0.1-0.2就足够。太多的酶可能会有星活性。
2、如果DNA提取质量高，没有蛋白污染，那么过夜没问题，否则也不建议超长时间酶切；
3、用多少质粒不是看体积，只要100ng就看得见，先定量质粒。做双酶切，如果2个片段都不太小，那么用200ng的质粒保证可以看见。你的质粒DNA加太多了
所以酶切体系可以改改，减少DNA和酶的量，减...
全部展开
1、我不建议酶用1ul，商品化的酶都是浓缩酶，0.1-0.2就足够。太多的酶可能会有星活性。
2、如果DNA提取质量高，没有蛋白污染，那么过夜没问题，否则也不建议超长时间酶切；
3、用多少质粒不是看体积，只要100ng就看得见，先定量质粒。做双酶切，如果2个片段都不太小，那么用200ng的质粒保证可以看见。你的质粒DNA加太多了
所以酶切体系可以改改，减少DNA和酶的量，减少时间。1小时足够完成预期的反应。
4、其它问题无法回答，因为：是否BamH1/ Hind3都是单一位点？4种样品是一个质粒还是？酶确定没问题？是不是所有双酶切都有1kb片段，大小是否符合预期？
收起