双链RNA提取方法以及每一步的原理是什么水稻叶片的双链RNA
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/05/07 15:06:43
双链RNA提取方法以及每一步的原理是什么水稻叶片的双链RNA
双链RNA提取方法以及每一步的原理是什么
水稻叶片的双链RNA
双链RNA提取方法以及每一步的原理是什么水稻叶片的双链RNA
真菌菌丝的总RNA的提取
RNA提取缓冲液（CTAB）：2% CTAB（W/V）,2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V）,100 mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置）,25mM EDTA,0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇（V/V,使用前加入）.由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可.
SSTE：1 M NaCl,0.5% SDS（W/V）,10 mM Tris-HCl pH8.0,1.0 mM EDTA
10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌.
3M NaAc
氯仿:异戊醇（24:1）
酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）
DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌
无水乙醇
70%酒精
1.实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL加80ul,50mL中加入300ul）.
2.取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了）,在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50 mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀.
3.65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
4.加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000 rpm,4℃,5 min）
5.取上清,等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000 rpm,4℃,5 min）
6.加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6hr以上(或过夜)
7.10,000 rpm,4℃离心20 min
8.弃上清,用500 ulSSTE溶解沉淀
9.酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次,氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000 rpm,4℃,5 min）
10.加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30 min以上
11.12,000 rpm,4℃离心20 min
12.弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
13.加200 ul的DEPC处理水溶解
14.用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
（在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数）
注意：提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短.