为什么PCR时会有杂带?引物没有污染,退火温度改了好多次,是特异性不好吗?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/05/11 03:33:38
为什么PCR时会有杂带?引物没有污染,退火温度改了好多次,是特异性不好吗?
为什么PCR时会有杂带?引物没有污染,退火温度改了好多次,是特异性不好吗?
为什么PCR时会有杂带?引物没有污染,退火温度改了好多次,是特异性不好吗?
你做的什么PCR?是real-time?EtBr染色的?
可能性较大的是,1,非特异性结合,2,形成primer dimer
先画个标准曲线吧
非特异性条带的出现.其原因:一是引物与靶序列不完全互补. 或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高.退火温度过低.及PCR循环次数 过多有关.其次是酶的质和量.往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现.酶量过多有时也会出现非特异性扩增.其对策有:①必要时重新设计引 物.②减低酶量或调换另一来源的酶.③降低引物量.适当增加模板量.减少循环次 数.④适当提高退火温度或采用二温度点...
全部展开
非特异性条带的出现.其原因:一是引物与靶序列不完全互补. 或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高.退火温度过低.及PCR循环次数 过多有关.其次是酶的质和量.往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现.酶量过多有时也会出现非特异性扩增.其对策有:①必要时重新设计引 物.②减低酶量或调换另一来源的酶.③降低引物量.适当增加模板量.减少循环次 数.④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性.65℃左右退火与延伸).
收起
很可能是你的引物设计的有问题。
你的引物1和引物2是一样的吗？还是两种不同的引物？或者你的两个样品是一样的吗？
多个条带很可能是你的引物还可以和你的模板dna上的非目的区域结合。你用的是质粒还是cDNA做的模板？如果是质粒的话可能你设计的引物只考虑了目的基因的序列忽略了载体序列
其实如果你知道自己要的条带是哪条并且跟别的条带分的很开的话有非特异性条带也无所谓的，回收个胶就行...
全部展开
很可能是你的引物设计的有问题。
你的引物1和引物2是一样的吗？还是两种不同的引物？或者你的两个样品是一样的吗？
多个条带很可能是你的引物还可以和你的模板dna上的非目的区域结合。你用的是质粒还是cDNA做的模板？如果是质粒的话可能你设计的引物只考虑了目的基因的序列忽略了载体序列
其实如果你知道自己要的条带是哪条并且跟别的条带分的很开的话有非特异性条带也无所谓的，回收个胶就行。或者你还不放心可以把目的条带切下来回收之后以它为模板再pcr
收起