我做的RT-PCR怎么样让内参一致?刚入门 老板让做内参的条件 反复做也没有要P出来的目的条带 我的退火温度是55 可以的 但是用这个条件去P 其他的样就P不出来 应该怎么办?
来源：学生作业帮助网 编辑：六六作业网 时间：2024/05/03 07:40:29
我做的RT-PCR怎么样让内参一致?刚入门 老板让做内参的条件 反复做也没有要P出来的目的条带 我的退火温度是55 可以的 但是用这个条件去P 其他的样就P不出来 应该怎么办?
我做的RT-PCR
怎么样让内参一致?刚入门 老板让做内参的条件 反复做也没有要P出来的目的条带 我的退火温度是55 可以的 但是用这个条件去P 其他的样就P不出来 应该怎么办?
我做的RT-PCR怎么样让内参一致?刚入门 老板让做内参的条件 反复做也没有要P出来的目的条带 我的退火温度是55 可以的 但是用这个条件去P 其他的样就P不出来 应该怎么办?
楼上的大哥,我的神啦,内参如果不是用同样退火温度,不是跟被测基因同时p的话,还好叫内参的吗?
不过这得怪楼主没有说清楚,RT是反转录还是说real time的定量PCR啦?
如果是反转录的话,好像是叫loading control 而非internal control啊．．．用cDNA做个半定量的PCR实在很少见过这个出问题的.楼上说不必用相同退火温度也是没错,但是所谓p出loading control的量来调整模板的量还真是神奇的说法,普通PCR没办法定量啊.看到条带暗你就去加多模板?加多少你知道么?
如果是real time,你需要好好去计算下所有引物的退火温度,到底是不是统一,不一样的话：1.用被测基因引物的退火温度跑个普通PCR,条带到底出不出,2.确认被测基因引物没有问题以后,按照它的退火温度,设计一个配套的内参引物.
话说回来,所谓老板让做内参的条件,拜托你也检验一下,老板不是神啊.
p内参和其他基因不一定非要用相同的退火温度，内参的目的是让你的RNA样品的量一致，这样才能看出你的目的基因在不同的样品中的量是否有差异。因此你需要通过p出的内参的量来调整模板的量，当模板量调整一致时，就用目的基因需要的退火温度直接p目的基因就可以了。
另外需要注意的是，p内参时设定的循环数不能过多，如果太多的话会出现过饱和，也不能准确的看出差异。
糟油酒丸，有那么诧异吗？半定量...
全部展开
p内参和其他基因不一定非要用相同的退火温度，内参的目的是让你的RNA样品的量一致，这样才能看出你的目的基因在不同的样品中的量是否有差异。因此你需要通过p出的内参的量来调整模板的量，当模板量调整一致时，就用目的基因需要的退火温度直接p目的基因就可以了。
另外需要注意的是，p内参时设定的循环数不能过多，如果太多的话会出现过饱和，也不能准确的看出差异。
糟油酒丸，有那么诧异吗？半定量PCR原理就是用内参调整不同样品的模板量，看同一个基因在不同样品间的转录水平。
收起
这个．．．．．一套一套的看不懂，什么是内参？internal control？
目的条带？是指internal control的product？
p是指pcr？
你的条件是指啥？？
不知道你说的“退火温度是55 可以的”什么意思。是说有的P出来有的没有P出来吗？既然是做半定量（或者定量）的话，那肯定是针对同一个看家基因咯，那没有P出来的样就是表达量低嘛~加模板~~
要是你的意思是 没有一个样被P出来，但是55度是别人告诉你可行的话。。。那你问别人的cDNA要来，也跑跑看看是不是你的TAQ酶什么的出问题了。。。
cDNA先测下260 280看看浓度有没有问题。你...
全部展开
不知道你说的“退火温度是55 可以的”什么意思。是说有的P出来有的没有P出来吗？既然是做半定量（或者定量）的话，那肯定是针对同一个看家基因咯，那没有P出来的样就是表达量低嘛~加模板~~
要是你的意思是 没有一个样被P出来，但是55度是别人告诉你可行的话。。。那你问别人的cDNA要来，也跑跑看看是不是你的TAQ酶什么的出问题了。。。
cDNA先测下260 280看看浓度有没有问题。你也可以试试别的HOUSE KEEPING GENE，看是不是模板有问题
嗯。。。。。。。我也就本科的时候做过一段时间半定量。。。也是学识浅薄型的，不知道有没有回答到点子上
收起